ELISA试剂盒测定步骤

ELISA试剂盒测定步骤

用于夹心ELISA试剂盒

1. 确定用于稀释标准液，空白液和样品的孔。为标准液准备7孔，为空白样品准备1孔。将100μL标准品（阅读《试剂制备》）的稀释液，空白液和样品各加入适当的孔中。用平板封口机盖上。在37 ^o C下孵育2小时。
2. 从每个孔中除去液体，请勿清洗。
3. 向每个孔中添加100μL检测试剂A工作溶液（即用型试剂盒中的检测溶液A）。用平板封口器覆盖后，在37 ^o C下孵育1小时。
4. 吸出溶液并使用喷瓶，多通道移液器，歧管分配器或自动清洗器在每个孔中用350μL的1×清洗溶液洗涤，静置1〜2分钟。将平板轻拍到吸水纸上，从所有孔中完全清除残留的液体。彻底清洗3次。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去所有剩余的洗涤缓冲液。翻转板并将其吸在吸水纸上。
5. 向每个孔中添加100μL检测试剂B工作溶液（即用型试剂盒中的检测溶液B）。用平板封口器覆盖后，在37 ^o C下孵育1小时。
6. 重复吸取/冲洗过程，总共重复5次，如步骤4所述。
7. 向每个孔中添加90μL底物溶液。盖上新的平板封口机。在37 ^o C下孵育15-25分钟（不要超过30分钟）。避光。添加底物溶液后，液体将变成蓝色。
8. 向每个孔中添加50μL终止溶液。加入Stop溶液后，液体将变为黄色。通过敲击板的侧面来混合液体。如果颜色变化不均匀，请轻轻敲打板以确保充分混合。
9. 除去印版底部的所有水滴和指印，并确认液体表面没有气泡。运行酶标仪，立即在450nm处进行测量。

用于竞争性ELISA试剂盒

1. 确定用于稀释标准液，空白液和样品的孔。为标准液准备7孔，为空白样品准备1孔。分别将50μL标准品（阅读《试剂制备》），空白和样品的稀释液分别加到适当的孔中。然后立即向每个孔中添加50µL检测试剂A（即用型试剂盒中的检测溶液A）。轻轻摇动平板（建议使用微孔板振荡器）。用平板封口机盖上。在37 ^o C下孵育1小时。检测试剂A可能看起来混浊。温热至室温，轻轻混合直至溶液均匀。 
2. 吸出溶液，并使用喷瓶，多通道移液器，歧管分配器或自动清洗器用350μL1×清洗溶液清洗每个孔，并静置1-2分钟。将平板轻拍到吸水纸上，从所有孔中完全清除残留的液体。彻底清洗3次。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去所有剩余的洗涤缓冲液。翻转板并将其吸在吸水纸上。
3. 向每个孔中添加100μL检测试剂B工作溶液（即用型试剂盒中的检测溶液B）。用平板封口器覆盖后，在37 ^o C下孵育1小时。
4. 重复吸取/冲洗过程，总共5次，如步骤2所述。
5. 向每个孔中添加90μL底物溶液。盖上新的平板封口机。在37 ^o C下孵育15-25分钟（不要超过30分钟）。避光。加入底物溶液后，液体将变成蓝色。
6. 向每个孔中添加50μL终止溶液。加入Stop溶液后，液体将变为黄色。通过敲击板的侧面来混合液体。如果颜色变化不均匀，请轻轻敲打板以确保充分混合。
7. 除去印版底部的所有水滴和指印，并确认液体表面没有气泡。运行酶标仪，立即在450nm处进行测量。

注意：

1. 分析准备：为每个实验保留适当数量的孔，并从微孔板中移出多余的孔。对于传统试剂盒，应将剩余的孔重新密封并保存在-20 ^o C，对于即用型试剂盒应在4 ^o C 储存。  
2. 样品或试剂的添加：仅使用新鲜制备的标准液。小心地将样品添加到孔中并轻轻混合以避免起泡。不要触摸井壁。对于该过程的每个步骤，将试剂或样品添加到测定板上的总分配时间不应超过10分钟。这将确保每个移液步骤的耗时相等，而不会中断。建议重复所有标准和样品，尽管不是必需的。为避免交叉污染，请在添加标准品，样品和试剂之间更换移液器吸头。另外，每种试剂都应使用分开的容器。
3. 孵育：为确保准确的结果，在孵育步骤中必须适当密封平板密封剂。在孵育步骤之间，请勿让孔长时间暴露于裸露状态。一旦将试剂添加到孔板中，在测试过程中任何时候都不要让其干燥。孵育时间和温度必须控制。
4. 洗涤：洗涤程序很关键。在每个步骤中彻底清除液体对于套件的良好性能至关重要。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去所有残留的洗涤液，并除去板底上的水滴或指印。洗涤不充分将导致精度下降和吸光度读数错误。
5. 反应时间的控制：加入TMB底物后观察颜色变化（例如，每10分钟观察一次），如果颜色太深，请提前添加Stop Solution以避免过度强烈的反应，这会导致吸光度读数不准确。
6. TMB基材  很容易被污染。保护它免受光以及物理污染物的侵害。 
7. 环境湿度可能会影响从试剂盒获得的结果。如果您所在设施的湿度小于60％，则建议使用加湿器。