线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）

线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）

产品概述 product description

线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）是利用JC-1探针检测线粒体膜电位变化的试剂盒，可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。 本试剂盒染料JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential）△Ψm的理想荧光探针。与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123相比，特异性更高，对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化，对线粒体去极化检测的检测一致性更好；红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化，不受线粒体大小，形状，密度的差异干扰；检测灵敏度强，对细胞应激反应的微小异质性都能辨别。 JC-1有单体和聚合体两种形式，两者的发射光谱不同。JC-1单体(J-monomer)的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。 JC-1可以透过细胞质膜进入细胞，以单体状态游离于胞质内，正常健康细胞的线粒体的膜电位较高，具有极性，JC-1 依赖于膜电位的极性被迅速摄入线粒体的基质内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体488nm激发时的最大发射波长为590nm，发射光为橙红色荧光，在流式图上表现为FL1和FL2双阳性；当细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，线粒体膜电位较低，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，从线粒体内释放到细胞质，此时JC-1为单体，488nm激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图中细胞FL1为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。 贝博® BBcellProbe® 可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以为您提供各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品，以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。

保存温度

-20℃ 避光

注意事项

1.开盖前请离心。
2.开盖后组份按要求条件保存。
3.拆封后请尽快使用完！

有效期

1年

检测方法

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

适用样本

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

产品应用

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

仪器准备

1.流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

试剂准备

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

耗材准备

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔

使用方法

悬浮细胞
1. 收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。细胞数量在2-5X105个。
2. 用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。
3. 用500ul JC-1染色工作液将细胞重悬，37℃，5% CO2的培养箱中孵育15-30分钟。
4. 在4°C，300-500×g力离心间5分钟，弃培养基，收集细胞。
5. 用冷PBS洗涤细胞两次。
6. 用500ul PBS将细胞重悬。
7. 用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

贴壁细胞
对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。


纯化线粒体
1. 把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1孵育缓冲液(1×)稀释5 倍。
2. 0.9mL 5倍稀释的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100ug的纯化的线粒体。
3. 结果检测。

组织样本
组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

常见问题分析

1.阳性对照如何设置？
如果要制备阳性对照细胞，可以用去极化药物羰基氰化物间氯苯腙CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照，按以下方法操作： CCCP加入到细胞培养液中，终浓度10uM，处理细胞20 分钟。随后进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μM CCCP处理20 分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1 染色后观察应呈绿色荧光;而正常的细胞经JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。
2.如何判断线粒体膜电位变化？
不能单独用红色或绿色荧光强度来判断线粒体膜电位，而必须使用红绿荧光的相对变化，即红绿荧光强度的比值做为指标来判断膜电位变化。
以细胞群的平均红、绿荧光强度，计算红/绿荧光强度的比值（Ratio），根据重复实验数据，对Ratio进行统计，反映膜电位变化。
流式分析时，相对于正常对照，凋亡阳性处理的细胞群会往右下方发生移动，即红色荧光减弱，绿色荧光增强，这表明阳性处理导致线粒体膜电位下降。